Biodegradación del Poliéster Poliuretano por Hongos:

‎ Biodegradación del poliéster poliuretano por hongos endofíticos.

 La biorremediación es un enfoque importante para la reducción de desechos que se basa en procesos biológicos para descomponer una variedad de contaminantes. Esto es posible gracias a la gran diversidad metabólica del mundo microbiano. Para explorar esta diversidad para la descomposición del plástico, seleccionamos varias docenas de hongos endofíticos por su capacidad de degradar el polímero sintético poliéster poliuretano (PUR). Varios organismos demostraron la capacidad de degradar eficientemente PUR tanto en suspensiones sólidas como líquidas.

Se observó una actividad particularmente robusta entre varios aislamientos en el género Pestalotiopsis, aunque no era una característica universal de este género. Dos microspora de Pestalotiopsis, los aislados fueron capaces de crecer en PUR como la única fuente de carbono en condiciones aeróbicas y anaeróbicas. La caracterización molecular de esta actividad sugiere que una serina hidrolasa es responsable de la degradación de PUR. La amplia distribución de la actividad observada y el caso sin precedentes de crecimiento anaeróbico utilizando PUR como única fuente de carbono sugieren que los endófitos son una fuente prometedora de biodiversidad a partir de la cual detectar propiedades metabólicas útiles para la biorremediación.

INTRODUCCIÓN:

Los enormes aumentos en la fabricación y el consumo de plásticos en las últimas décadas han generado numerosas preocupaciones ecológicas y económicas. La persistencia de los polímeros sintéticos introducidos en el medio ambiente por la industria humana plantea una gran amenaza para los sistemas ecológicos naturales. El bajo costo y la facilidad de fabricación han aumentado la demanda mundial de plástico más de 150 veces, con la producción de 1,5 millones de toneladas en 1950 y 245 millones de toneladas a partir de 2006 (21). A pesar del reconocimiento de los persistentes problemas de contaminación que plantea el plástico, la producción mundial sigue aumentando, con los mayores aumentos esperados en los países en desarrollo.

El gran volumen de plásticos producidos cada año presenta un problema para los sistemas de eliminación de residuos. La escala de este problema y la recalcitrancia de algunos polímeros a la degradación requieren la investigación de métodos efectivos para la biodegradación de los plásticos. Al comprender los mecanismos de degradación del polímero, se puede lograr una técnica más eficiente para la biodegradación de los desechos plásticos. Para lograr este objetivo, los investigadores necesitan un mayor conocimiento de cómo los compuestos son metabolizados por los organismos existentes, una investigación de nuevos organismos con potencial de biorremediación y la caracterización de nuevas capacidades metabólicas. El poliuretano de poliéster (PUR) es un plástico ampliamente utilizado en la industria y la fabricación que ha demostrado ser susceptible a la biodegradación (6,10).

El polímero se genera por la condensación de un poliisocianato y un poliol. Esto da como resultado un polímero de carbono compuesto por una serie de enlaces de uretano. Las variaciones en el espacio entre los enlaces de uretano, así como la naturaleza de las sustituciones, pueden cambiar las propiedades del polímero resultante de lineal y rígido a ramificado y flexible. En una suspensión líquida, el PUR aparece blanco lechoso y completamente opaco. Al igual que otros poliuretanos, este producto se sintetiza comercialmente para la fabricación de textiles y recubrimientos textiles. Se ha demostrado la degradación enzimática de PUR por hongos (4,5,19) y bacterias (11,12,14,15,17,18,23).Los hongos del suelo comprenden la mayoría de los organismos seleccionados para determinar la actividad de degradación de PUR (4,5).

Hongos de los géneros Alternaria, Aspergillus, Phoma, Pennicilium, Plectosphaerella, Geomyces, Nectria y Neonectria se aisló con acceso a fuentes de nutrientes mixtas de muestras de PUR enterradas (4). Geomyces pannorum fue el organismo que degrada PUR más comúnmente aislado con este método (4). Pocos organismos han demostrado degradar PUR como única fuente de carbono. Aspergillus niger tiene alguna actividad de degradación reportada;sin embargo, se observó que era bastante lento, con signos visibles de degradación que ocurrían solo después de 30 días (7).

Las poliuretanasas putativas se han aislado y caracterizado a partir de extractos de proteínas de varios organismos, incluidas las bacterias Pseudomonas chlororaphis(25) y Comamonas acidovorans(1,2), así como el hongo Candida rugosa(8). Las enzimas activas se han clasificado como esterasas (5,13,16), lipasas (26) y proteasas y ureasas(19), lo que sugiere la degradación del sustrato PUR mediante la escisión del enlace éster. En un esfuerzo por identificar nuevos organismos con nuevas capacidades metabólicas para la degradación de los polímeros, nos hemos embarcado en un esfuerzo por explorar la diversidad biológica y química de los endófitos.

Esto se logró como parte de un programa educativo para involucrar a los estudiantes universitarios en la investigación basada en el descubrimiento (9,28). Los endófitos son microorganismos hiperdiversos, incluidas bacterias y hongos, que viven dentro de los tejidos internos de las plantas sin causar síntomas evidentes de la enfermedad (3).Estos organismos entran en sus anfitriones mediante la penetración de las superficies exteriores, y algunos juegan un papel clave en la descomposición de plantas después de la muerte del tejido huésped(3).

De hecho, hongos como estos contribuyen a la descomposición de los polímeros de lignocelulosa y son los principales contribuyentes al ciclo del carbono(3,22,24). La capacidad de estos microorganismos para degradar un polímero tan complejo como la lignocelulosa sugeriría que estos organismos prometen su capacidad para degradar otros polímeros complejos, como los presentes en los plásticos. El nicho biológico único de los endófitos como endosimbiontes de tejidos ricos en polímeros de carbono complejos justifica la investigación de sus capacidades metabólicas más amplias. Cada una de las más de 300,000 especies de plantas terrestres en la Tierra potencialmente alberga múltiples especies endófitas.

Solo se ha examinado una pequeña muestra de plantas por sus asociaciones endofíticas, sin embargo, muchos de estos organismos se pueden cultivar fácilmente (3,25,28). Los endófitos alcanzan su mayor diversidad en los bosques tropicales. Los árboles individuales pueden albergar cientos de especies endofíticas, algunas de las cuales son conocidas, pero muchas de ellas son nuevas para la ciencia (25). En el estudio actual, se aislaron endófitos de tallos de plantas recolectados en la selva ecuatoriana. Se analizó un subconjunto de estos organismos por su capacidad para degradar el poliuretano.

Se identificaron varios organismos activos, incluidos dos aislados distintos de la microspora de Pestalotiopsis con la capacidad de degradar eficientemente y utilizar PUR como la única fuente de carbono cuando se cultiva anaeróbicamente, una observación única entre las actividades de biodegradación de PUR reportadas.

MATERIALES Y MÉTODOS:

Muestreo de plantas. Se recolectaron plantas leñosas de varias familias en el Bosque Nacional Yasuní en la selva amazónica ecuatoriana. Algunas plantas fueron atacadas por sus supuestos usos etnobotánicos, mientras que otras fueron muestreadas al azar.

Se recogió una muestra de tallo de 10 cm y se almacenó en una bolsa de polietileno hermética a 4 ° C. Las muestras de herbario fueron preparadas y depositadas en el Herbario Peabody de la Universidad de Yale y el Herbario Nacional del Ecuador (QCNE). Aislamiento de endofitos. Los tallos de las plantas se esterilizaron superficialmente por inmersión en etanol durante 10 s seguido de un breve flameado. Se retiraron las capas externas de tejido de los tallos y se sembraron tres secciones de los tejidos internos de cada muestra en agar de dextrosa de papa (PDA) (Difco), una dilución 1:10 de medio de dextrosa de papa en agar de agua (WA), un Dilución 1:10 de medio de glicerol arginina (GAM) en placas WA y WA (25). Todas las placas fueron selladas con Parafilm y monitoreadas cada 2 a 3 días para el crecimiento. A medida que se detectó el crecimiento de microbios, los organismos fúngicos se aislaron transfiriendo una punta hifal a placas PDA nuevas.

Las placas se envolvieron nuevamente con Parafilm y se almacenaron en recipientes de plástico. Las reservas permanentes de cada organismo se hicieron cultivando los organismos en semillas de cebada con autoclave triple y almacenándolas a -80 ° C. Secuenciación y análisis filogenético. Los cultivos endófitos se cultivaron en placas PDA durante 1 a 2 semanas a temperatura ambiente. Se extrajo el ADN de aproximadamente 100 mg de material fúngico usando el minikit de plantas Qiagen DNeasy. Se usaron aproximadamente 10 ng de ADN como plantilla para amplificar la región del espaciador transcrito interno (ITS) del ADN ribosómico (ADNr) mediante PCR como se describió anteriormente (30).

Los cebadores utilizados para la secuenciación de ITS fueron ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGGG-3') e ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'), correspondientes a los cebadores directo e inverso (30) Se verificó la longitud de los fragmentos amplificados usando electroforesis en gel de agarosa y se purificó usando un kit de purificación por PCR QIAquick (Qiagen). La secuenciación se realizó en la instalación WM Keck de la Universidad de Yale en máquinas de analizador de ADN 3730cL de Applied Biosystems.

Las secuencias directa e inversa para cada organismo se alinearon usando los programas Pregap4 y Gap4(25).Las secuencias endófitas se alinearon con los organismos presentes en la base de datos GenBank el 1 de agosto de 2008 utilizando la Herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST) del Centro Nacional de Información Biotecnológica

Pantalla inicial de autorización de PUR. Los endófitos se analizaron primero para determinar su capacidad de degradar PUR al cultivarlos en presencia de Impranil DLF, una dispersión de PUR acuosa alifática aniónica con 4% de N-metil pirrolidona (NMP) (Bayer MaterialScience). Se cultivaron cincuenta y nueve endófitos fúngicos en medio PUR sólido (PUR-A) que contenía NaH24;19 mM, K2HPO433,5 mM, 7,6 mM (NH4)2SO4, citrato de Na 2,5 mM, MgSO250 μM, 19 μM tiamina, 0.05% de Casaminoácidos, 147 μM FeCl3· 6H2O, 14 μM ZnCl· 4H2O, 12 μM CoCl2· 6H2;O, 12 μM Na2MoO4· 2H2O, 10 μM CaCl2· 2H2O, 11 μM CuCl2, 12 μM MnCl2, 12 μM H3BO3 y 1.8 mM HCl. A 1 litro de esta mezcla se añadieron 10 ml de Impranil DLF y 15 g de agar.

El polímero se añadió después de esterilizar en autoclave el medio para evitar la deformación. El ensayo de cribado en medio sólido siguió el método general de Crabbe et al(5). El medio sólido PUR-A se añadió a tubos de cultivo estériles en alícuotas de 10 ml. A 0,5-cm3 se añadió enchufe de adulto hongo en PDA a cada tubo de ensayo utilizando una técnica aséptica y se dejó crecer en reposo a 23 ° C. La bacteria Pseudomonas chlororaphis(ATCC 55729, de Gary Howard) y el hongo Aspergillus niger(de Gary Strobel, Montana State University) se utilizaron como controles positivos para la degradación del poliuretano (6,7,13).

La degradación de PUR se evidenció por un cambio en la apariencia del medio de opaco a translúcido. Después de 2 semanas de incubación, se midió la profundidad del aclaramiento de poliuretano desde la parte superior del medio hasta el punto más bajo del aclaramiento visible. El ensayo de medio líquido siguió el método descrito por Gautam et al.(8) El medio líquido PUR-L se preparó usando la misma receta que para el medio PUR-A sólido sin agar. PUR-L medio se añade a tubos de cultivo estériles en alícuotas de 10 ml y se inoculó con un 0,5-cm3 enchufe de adulto hongos en PDA. Al final de 2 semanas, los cultivos líquidos se homogeneizaron por agitación vigorosa.

Una porción de 1,5 ml de cada cultivo se transfirió a un tubo Eppendorf y se centrifugó durante 1 minuto a 4.200 ×g en una centrífuga Eppendorf MiniSpin para granular selectivamente la materia fúngica. La absorbancia del líquido sobrenadante se midió en un espectrofotómetro Varian Cary 50 Bio UV-visible a una longitud de onda de 600 nm, con agua estéril como blanco. Se midieron las diluciones del medio PUR-L con agua estéril para construir una curva estándar para convertir la absorbancia en porcentaje de aclaramiento.

Las muestras se midieron cada día durante 2 semanas para la absorbancia óptica para determinar una tasa relativa de aclaramiento. Único ensayo de fuente de carbono. Los organismos identificados con actividad degradante de PUR fueron probados para determinar su capacidad de usar PUR como única fuente de carbono. Para estos estudios, el sustrato era Impranil DLN, que contiene PUR suspendido solo en agua (no hay N-metil pirrolidona presente).

Esto aísla al Impranil como la única fuente de carbono para el metabolismo y el crecimiento. Los cinco principales organismos de las pantallas de actividad inicial se cultivaron en Impranil DLN sin otras fuentes de carbono (PUR-L min). Las muestras de hongos se lavaron antes de la inoculación para eliminar todo el medio residual. Estas dos consideraciones, el lavado y el sustrato DLN, aseguran que el polímero sea la única fuente de carbono para el crecimiento y el metabolismo fúngico.PUR-L min se preparó de manera similar a la del medio PUR-L pero en ausencia de citrato de sodio, tiamina, ácidos casamino o agar.

El organismo Aspergillus niger se probó como base para la comparación. Cultivos de hongos se cultivaron durante 1 semana en caldo de papa dextrosa (PDB). Los cultivos de reserva se homogeneizaron mediante agitación vigorosa, y 1 ml de cada cultivo se centrifugó a 12.100 ×g durante 1 minuto. Se retiró el sobrenadante y se resuspendió el sedimento fúngico en 1 ml del medio líquido PUR-L min.Las muestras fueron centrifugadas y resuspendidas por segunda vez para asegurar la eliminación de todos los PDB residuales. La muestra de 1 ml de material fúngico lavado se añadió a tubos de cultivo estériles hasta un volumen final de 10 ml de PUR-L min. Los cultivos se monitorizaron para determinar el aclaramiento visual del medio opaco.

Las muestras se midieron cada 2 días durante 2 semanas para la absorbancia óptica a 600 nm para determinar una tasa aproximada de aclaramiento. Se midió un aumento en la masa fúngica que se correlaciona con la degradación de PUR liofilizando la masa micelial de cultivos por triplicado que contienen medio mínimo con y sin PUR. Degradación anaeróbica de PUR. Se incubaron tubos de cultivo que contenían alícuotas de 9 ml de medio PUR-L min y 1 ml de inóculos fúngicos lavados en condiciones anaerobias.

El ambiente anaerobio se generó usando una cámara anaerobia BD GasPak. Los cultivos líquidos de cada aislado se inocularon por duplicado. Se colocó un conjunto dentro de la cámara anaeróbica y el conjunto de control se colocó fuera de la cámara en un entorno aeróbico. Ambos conjuntos fueron incubados a 25 ° C durante la duración del estudio. Después de 1 y 2 semanas, se retiraron las muestras y se determinó el aclaramiento por absorción a 600 nm. Análisis IR de degradación de PUR. Infrarrojos (IR) espectros de PUR-L líquidos min suspensiones se recogieron cada 48 h usando un espectrómetro de infrarrojos Nicolet 6700.

Se extrajo una porción de 50 μl de cada muestra para cada medición y se centrifugó durante 60 s a 4.200 ×gpara sedimentar el material fúngico de las muestras sin una sedimentación significativa del polímero. Se recogieron espectros de muestra líquida usando agua desionizada como espectro de fondo. Las mediciones se realizaron hasta que se observó una degradación completa de PUR en el cultivo de 10 ml en 2 semanas. Caracterización enzimática de la poliuretanasa putativa. Se preparó una fracción de enzima extracelular haciendo crecer un cultivo líquido de 1 litro del organismo más activo, Pestalotiopsis microspora E2712A, en medios PUR-L min y PDB. Después de 10 días de incubación a 30 ° C, el cultivo se filtró a través de un filtro de 0,22 μm en un recipiente estéril.

El extracto extracelular crudo se almacenó a 4 °C. Para evaluar la actividad de una enzima extracelular, se añadieron 4 ml de extracto a 6 ml de medio PUR-L min. Las muestras se incubaron durante 2 h en una incubadora rotativa a 30 ° C. Se usaron tres inhibidores basados ​​en mecanismos para caracterizar la actividad. Se añadió fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), un inhibidor de la serina hidrolasa, a una alícuota de extracto enzimático y se añadió al medio PUR-L min a una concentración final de 1mM.

Se añadió yodoacetato, un inhibidor de la cisteína hidrolasa, a una concentración final de 10 μM. Se usó EDTA a una concentración de 5 mM como inhibidor de metalohidrolasa. El extracto que se trató con calor a 98 ° C durante 20 min sirvió como control negativo. Las muestras fueron incubadas en una incubadora rotativa a 30 ° C, y el aclaramiento se observó macroscópicamente después de 2 h. Sobre la base de las observaciones iniciales de que una serina hidrolasa estaba implicada en la degradación de PUR, se utilizaron sondas basadas en la actividad para analizar la proteína serina hidrolasa en filtrados sin células crudas.

Las moléculas de la sonda contienen un resto fluorofosfonato que reacciona específicamente con las serinas de enzimas en el sitio activo de la familia de las serina hidrolasas y una etiqueta de tetrametilrodamina (TMR) (20). Las reacciones del extracto de proteína cruda con la sonda se llevaron a cabo como se describió previamente (20). El gel de SDS-poliacrilamida resultante se visualizó usando un escáner de lecho fluorescente Fujifilm FLA-5100 con excitación a 532 nm y un filtro de emisión de 570 nm. El mismo gel se tiñó de plata para visualizar todas las proteínas en las muestras. La proteína cruda del filtrado libre de células de Pestalotiopsis microspora E2712A cultivada en cultivos de 1 litro de medio mínimo PUR-L min y medio rico en PDB se concentró y purificó hasta aproximadamente 90% de pureza mediante cromatografía de filtración en gel (datos no mostrados) usando un Superdex 200 columna (GE Healthcare) en tampón compuesto por MES 10 mM (ácido morfolina-metanosulfónico)(pH 5,5) y NaCl 50 mM.

La capacidad de la proteína purificada para degradar PUR se ensayó como se describió anteriormente.

 RESULTADOS:

Pantalla inicial de autorización de PUR. Impranil DLN, un poliéster poliuretano (PUR), es una suspensión lechosa opaca que se vuelve transparente tras la degradación. Los organismos capaces de degradar este polímero exhiben una zona de eliminación alrededor del cultivo en crecimiento (5). Se analizó una colección de 59 organismos endofíticos fúngicos aislados de muestras de plantas en la Amazonía ecuatoriana por su capacidad para crecer y degradar poliéster poliuretano utilizando el ensayo de halo PUR como la pantalla inicial. De los organismos examinados, 18 organismos produjeron un halo de aclaramiento como el que se muestra en la figura 1. Otros dos organismos, identificados por su secuenciación ITS como Guignardia mangiferae(E2702C) y Zopfiella karachiensis (E2719A), podría crecer pero no degradar el medio PUR-A. Estos se utilizaron como controles negativos en los estudios posteriores.